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韓家淮課題組利用SWATH-MS研究LPS通路中複合物的動態變化

發布時間:2019-03-15來源:生命科學學院點擊數:1620

2019310号,细胞应激生物学国家重點實驗室、厦门大学生命科学学院韩家淮课题组在Molecular & Cellular Proteomics雜志發表了題爲“Quantification of dynamic protein interactions and phosphorylation in LPS signaling pathway by SWATH-MS”的研究論文,本文用SWATH-MS定量質譜技術系統性地研究了LPS信號通路中關鍵蛋白TRAF6MyD88NEMO複合物中的動態蛋白相互作用和磷酸化,揭示了在LPS刺激下Myddosome複合物中IRAK家族蛋白存在不同的招募速度。

LPS(脂多糖)是細菌細胞膜外膜一個主要的成分,其會被哺乳細胞的受體TLR4識別,並激活細胞內一系列信號通路,導致促炎細胞因子的釋放。LPS/TLR4信号通路已经研究多年,其中大部分关键的作用蛋白已经被鉴定,但是仍有一些问题尚未解决,比如复合物的动态组装是如何实现以及複合物中关键作用蛋白相对比例是多少。为了解决这些问题,我们拟利用SWATH-MS技術去定量分析LPS信號通路中的關鍵蛋白複合物。爲了純化蛋白複合物,我們分別建立了Flag-knockin TRAF6Flag-knockin MyD88和在NEMO敲除細胞中回補Flag-NEMO這三株RAW 264.7細胞系。我們利用LPS分别处理這三株细胞系十個时间点,然后用免疫亲和纯化(immunoprecipitation)的方法獲得蛋白質複合物,並用SWATH-MS分析這些樣品。


我們在30-40IP樣品中定量到2500-3000個蛋白,除此以外,我們在这些样品中鉴定到2000個左右的磷酸化位点。从这些定量数据中,我们成功地获得了所有的已知LPS信號通路中關鍵蛋白的动态变化信息。SWATH-MS結果顯示,IRAK家族蛋白在招募到MyD88上時,有明顯的時間先後之分,且與現有的報道不同。我們還分析了Myddosome中關鍵蛋白TIRAPMyD88的比列,顯示MyD88:TIRAP約爲5:1,表明MyD88在複合物中以多聚的形式存在。此外,我们还鉴定到关键蛋白上的一系列磷酸化位点,发现NEMO上一個未报道的磷酸化位点,此位点的突变会影响NEMO激活NF-kB的能力。

綜上,該研究系統地分析了LPS中蛋白複合物中關鍵蛋白动态变化和蛋白间的比例,且鉴定了一系列未报道的磷酸化位点,为后续的LPS信號通路研究提供了豐富的資源。

厦门大学博士後吴秀榕为文章的第一作者,通讯作者为韩家淮教授和钟传奇副教授。

原文鏈接:https://www.mcponline.org/content/early/2019/03/07/mcp.RA119.001380

(生命科學學院)